Anlage 2 MTWV – Mikrobiologische Untersuchungsverfahren

Anlage 2
(zu § 4 Abs. 3)

1. 1

   Escherichia coli und coliformen Keimen gemeinsam ist die Fähigkeit, bei einer Temperatur von 37 Grad Celsius +/- 1Grad Celsius Laktose innerhalb von 20 +/- 4 Stunden unter Gas- und Säurebildung abzubauen.

   1. 1.1

      Die Untersuchung auf Escherichia coli in mindestens 250 Milliliter Wasser kann durch:

      1. a)

         Flüssiganreicherung in doppelt konzentrierter Laktosebouillon, Bebrütungstemperatur 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius oder 42 Grad Celsius +/- 0,5 Grad Celsius, Bebrütungszeit 20 +/- 4 Stunden (Beobachtungszeit und Bebrütung bis 44 +/- 4 Stunden), oder

      2. b)

         Membranfiltration und Bebrütung des Membranfilters auf Laktose-Fuchsin-Sulfitagar (Endoagar), Bebrütungstemperatur 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius oder 42 Grad Celsius +/- 0,5 Grad Celsius, Bebrütungszeit 20+/-4 Stunden, erfolgen.

      Eine endgültige Diagnose ist durch das Stoffwechselmerkmal "Gas- und Säurebildung aus Laktose", bzw. Bildung von fuchsinroten Kolonien auf dem bebrüteten Membranfilter allein nicht möglich, sodass zusätzlich nach Sub- bzw. Reinkultur auf Endoagar mindestens folgende Stoffwechselmerkmale geprüft werden müssen:

      Cytochromoxydasereaktion: negativ

      Laktosevergärung: Gas- und Säurebildung bei 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius innerhalb 20 +/- 4 Stunden

      Indolbildung aus tryptophanhaltiger Bouillon: positiv

      Spaltung von Laktose, Dextrose oder Mannit bei 44 Grad Celsius +/- 0,5 Grad Celsius innerhalb von 20 +/- 4 Stunden zu Gas und Säure: positiv.

      Ausnutzung von Citrat als einziger Kohlenstoffquelle: negativ.

   2. 1.2

      Die Untersuchung auf coliforme Keime in mindestens 250 Milliliter Wasser kann durch:

      1. a)

         Flüssiganreicherung in doppelt konzentrierter Laktosebouillon, Bebrütungstemperatur 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius, Bebrütungszeit 20 +/- 4 Stunden (Bebrütung und Beobachtungszeit bis 44 +/- 4 Stunden), oder

      2. b)

         Membranfiltration und Bebrütung des Membranfilters auf Laktose-Fuchsin-Sulfitagar (Endoagar), Bebrütungstemperatur 37 Grad Celsius +/- Grad Celsius, Bebrütungszeit 20 +/- 4 Stunden,

      erfolgen.

      Eine endgültige Diagnose ist durch das Stoffwechselmerkmal "Gas- und Säurebildung aus Laktose" bzw. durch die Bildung von fuchsinroten Kolonien auf dem bebrüteten Membranfilter nicht möglich, sodass zusätzlich nach Sub- bzw. Reinkultur auf Endoagar mindestens folgende Stoffwechselmerkmale geprüft werden müssen:

      Cytochromoxydasereaktion: negativ

      Laktosevergärung: Gas- und Säurebildung bei 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius nach 44 +/- 4 Stunden

      Indolbildung aus tryptophanhaltiger Bouillon: in der Regel negativ (positive Reaktion möglich)

      Spaltung von Dextrose, Laktose oder Mannit zu Gas und Säure bei 44 Grad +/- 0,5 Grad Celsius innerhalb von 20+?- 4 Stunden : in der Regel negativ (positive Reaktion möglich)

      Ausnutzung von Citrat als einziger Kohlenstoffquelle: positiv oder negativ

      Coliforme Keime spalten also in jedem Falle Laktose bei 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius unter Gas- und Säurebildung, weichen aber in der Indolbildung und/oder im Zuckerabbau bei einer Bebrütungstemperatur von 44 Grad Celsius +/- 0,5 Grad Celsius und/oder im Citratabbau von den für Escherichia coli genannten Merkmalen ab.

2. 2

   Die Untersuchung auf Faekalstreptokokken kann durch:

   1. a)

      Flüssiganreicherung in doppelt konzentrierter Azid-Dextrose-Bouillon, Bebrütungstemperatur 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius, Bebrütungszeit 20 +/- 4 Sunden (Beobachtungszeit und Bebrütung bis 44 +/- Stunden), oder

   2. b)

      Membranfiltration und Bebrütung des Membranfilters entweder auf Tetrazolium-Natriumazid-Agar, Bebrütungstemperatur 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius, Bebrütungszeit 20 +/- 4 Stunden oder in einfach konzentrierter Azid-Dextrose-Bouillon, Bebrütungstemperatur 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius, Bebrütungszeit 20 +/- 4 Stunden (Beobachtungszeit und Bebrütung bis 44 +/- 4 Stunden)

   erfolgen.

   Die endgültige Diagnose ist durch Wachstum in Azid-Dextrose-Bouillon oder auf Tetrazolium-Natriumazid-Agar nicht möglich, sodass zusätzlich nach Sub- und Reinkultur auf Blutagar mindestens folgende Merkmale geprüft werden müssen:

   Aesculinabbau:

   positiv nach Verimpfen in Aesculinbouillon, Bebrütungstemperatur 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius, Bebrütungszeit 40 +/- 4 Stunden, Farbreaktion mit frischer 7%iger wässriger Lösung von Eisen-II-Chlorid

   Wachstum bei pH 9,6:

   positiv nach Verimpfen in Nährbouillon pH 9,6, Bebrütungstemperatur 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius, Bebrütungszeit 20 +/- 4 Stunden

   Wachstum bei 6,5%igem Kochsalzzusatz:

   positiv nach Verimpfen in Nährbouillon mit 6,5 % Kochsaltzzusatz, Bebrütungstemperatur 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius, Bebrütungszeit 20 +/- 4 Stunden.

3. 3.

   Die Untersuchung auf Pseudomonas aeruginosa kann durch:

   1. a)

      Flüssiganreicherung in doppelt konzentrierter Malachitgrünbouillon, Bebrütungstemperatur 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius, Bebrütungszeit 20 +/- 4 Stunden (Beobachtungszeit und Bebrütungszeit bis 44 +/- 4 Stunden), oder

   2. b)

      Membranfiltration und Bebrütung des Membranfilters in einfach konzentrierter Malachitgrünbouillon, Bebrütungstemperatur 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius, Bebrütungszeit 20 +/- 4 Stunden (Beobachtungszeit und Bebrütungszeit bis 44 +/- 4 Stunden),

   erfolgen.

   Die endgültige Diagnose ist durch Wachstum in Malachitgrünbouillon nicht möglich, sodass zusätzlich nach Sub- und Reinkultur auf Laktose-Fuchsin-Sulfitagar (Endoagar) oder einen anderen geeigneten Selektivagar mindestens folgende Stoffwechselmerkmale geprüft werden müssen:

   Bildung von Fluorescein:

   positiv nach Verimpfen auf das Medium nach King (B)F, Bebrütungstemperatur 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius, Bebrütungszeit 44 +/- 4 Stunden

   und Bildung von Pyocyanin:

   positiv nach Verimpfen auf das Medium nach King (A)P, Bebrütungstemperatur 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius, Bebrütungszeit 44 +/- 4 Stunden

   oder Bildung von Ammoniak aus Acetamid:

   positiv nach Verimpfen auf (ammoniumfreie) Acetamid-Standard-Mineralsalzlösung, Bebrütungstemperatur 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius, Bebrütungszeit 20 +/- 4 Stunden, positive Reaktion mit Nessler's Reagenz.

4. 4

   Die Untersuchung auf sulfitreduzierende, Sporen bildende Anaerobier kann durch

   1. a)

      Membranfiltration und Bebrütung des Membranfilters unter einer Schicht von Dextrose-Eisensulfat-Natriumsulfitagar, Bebrütungstemperatur 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius, Bebrütungszeit 20 +/- 4 Stunden, Beobachtung für weitere 20 +/- 4 Stunden, Auszählung der schwarzen Kolonien, oder

   2. b)

      Flüssiganreicherung in 50 ml doppelt konzentrierter Dextrose-Eisencitrat-Natriumsulfit-Bouillon, Bebrütungstemperatur 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius, Bebrütungszeit 20 +/- 4 Stunden, Beobachtung für weitere 20 +/- 4 Stunden, positiv bei Schwärzung des Flüssignährbodens,

   erfolgen.

5. 5

   Bestimmung der Koloniezahl

   Als Koloniezahl wird die Zahl der mit 6- bis 8facher Lupenvergrößerung sichtbaren Kolonien bezeichnet, die sich aus den in 1 ml des zu untersuchenden Wassers befindlichen Bakterien in Plattengusskulturen mit nährstoffreichen peptonhaltigen Nährböden (1 % Fleischextrakt, 1 % Pepton) bei einer Bebrütungstemperatur von 20 Grad Celsius +/- 2 Grad Celsius, nach 44 +/- 4 Stunden oder bei einer Bebrütungstemperatur von 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius nach 20 +/- 4 Stunden Bebrütungszeit bilden.

   Die verschiedenen bei der Bestimmung verwendeten Nährböden unterscheiden sich hauptsächlich durch das Verfestigungsmittel, sodass folgende Methoden möglich sind:

   1. 5.1

      Gelatinenährboden, Bebrütungstemperatur 20 Grad Celsius +/- 2 Grad Celsius,

   2. 5.2

      Agarnährboden, Bebrütungstemperatur 20 Grad Celsius +/- 2 Grad Celsius oder 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius,

   3. 5.3

      Kieselsäure-Phosphatbouillon-Nährboden, Bebrütungstemperatur 20 Grad Celsius +/- 2 Grad Celsius oder 37 Grad Celsius +/- 1 Grad Celsius.

6. 6

   Werden bei den Untersuchungen nach Nummer 1.2 und 2 bis 5 Ergebnisse erzielt, die auf eine Überschreitung der festgelegten Grenzwerte hindeuten, so ist an mindestens 4 weiteren Proben festzustellen, dass die Grenzwerte im Wasser nicht überschritten werden.